“蛋白表达”疑难解惑第九弹：昆虫表达。
Q1
对于杆状病毒表达系统的转染，有哪些一般性建议？
请遵循以下建议：
细胞应处于非常健康的状态，代数较低（5-15代），处于对数生长期，并且存活率高于95%。
DNA高度纯化，无内毒素
转染时，不可使用抗生素
Cellfectin试剂应重悬
设置对照组（培养基对照、DNA对照和转染试剂对照），用于对比和问题排查
Q2
病毒感染早期和末期有哪些形态改变？
请查看以下关于病毒感染不同阶段的描述：
早期
细胞直径增加：细胞直径可能增加25–50%。
细胞核体积增加：细胞核可能“填满”细胞。
末期
细胞生长停止：与单纯的细胞对照相比，细胞停止生长。
颗粒状外观
病毒出芽迹象：细胞出现泡状外观
病毒包涵体：少量细胞会含有包涵体，表现为昆虫细胞核内出现折射晶体。
脱落：细胞从培养皿或培养瓶上脱落。
晚期的细胞裂解：少量细胞可能会充满包涵体病毒、发生死亡和裂解，留下单层清理迹象。
Q3
我应如何保存病毒储液？
如果培养基是无血清的，可加入血清至浓度为10%。血清蛋白可作为蛋白酶的底物，防止病毒外壳蛋白发生降解。将病毒储液置于4°C避光保存。分装储液可保存在–80°C，使用前应检测病毒滴度，因为冻融循环会导致病毒滴度降低10-100倍。
Q4
你们能否概括出空斑实验法的主要步骤以及对该实验的建议？
以下是空斑实验法的主要步骤：
在6孔板中接种细胞，并使细胞到达80%融合
对P1病毒储液（1–10-5）进行连续稀释，并加到细胞中
在27°C孵育1小时
在培养基中混合1%融化的琼脂糖
移除病毒上清液
在细胞上覆盖含琼脂糖的培养基
将培养板静置2-3小时，使琼脂糖凝固
培养10-14天
计算空斑数量
Q5
进行该实验时，我们建议：
细胞应处于非常健康的状态，代数较低（10-20代），处于对数生长期，并且存活率高于95%
病毒储液是无菌的（无污染）
使用高质量、低熔点的琼脂糖
琼脂糖培养基的温度非常重要——太热，则细胞会死亡；太冷，则琼脂糖凝固太快
覆盖琼脂糖培养基后等待2-4小时，使琼脂糖达到凝固
在稀释的板中，空斑数量按下述公式计算：
（1/稀释度）x 空斑数量 = pfu/mL
例如，如果在稀释度为10-6的板中形成50个空斑，则为1/(10-6) x 50 = 5 x 107 pfu/mL
Q6
为繁殖得到更多的重组病毒储液，应使用的MOI是多少？应在何时收获病毒？
繁殖病毒储液时，为避免缺陷性干扰颗粒（DIP）的影响，应使用低MOI（0.03–0.1）。低MOI可确保每个细胞的病毒颗粒感染量低于1，防止DIP扩增。当细胞存活率为15%时，是合适的病毒收获时间。
注意：DIP是接近正常的病毒衣壳，含缺陷性基因组，无法进行成功的复制。尽管该“颗粒”本身无感染性，但当它与正常病毒颗粒或一些其他类型的DI颗粒共感染时，可以进行复制。
Q7
我的杆状病毒空斑实验未得到空斑。可能原因是什么？
感染动力学可能比预期要慢。继续观察培养板，直至感染后第8-9天。如果未出现空斑，则检查下面各项：
如果细胞不健康，会产生较差的空斑或无空斑产生。理想状态下，细胞应处于对数生长中期，并且存活率大于90%。在感染导致细胞停止生长前，细胞应至少倍增1次。应确保细胞接种量正确，且汇合度约为70%。
细胞营养不良和健康状态较差，都会抑制病毒复制周期。
琼脂糖温度也很关键。在琼脂糖覆层后，应将培养板静置1小时，使琼脂糖凝固。
在27°C孵育时，过度冷凝会抑制空斑形成——一旦发生冷凝，就应移除纸巾或打开装有培养板的容器。
病毒滴度过低：使用较高的病毒滴度。您可能需要再次感染细胞，并收集更高滴度的病毒储液。
Q8
我的琼脂糖覆层漂起来了。这是因为我没有将培养基吸走吗？
是的，这表明空斑上存在吸液问题。琼脂糖覆层“漂浮”，是因为板中的培养基未被全部吸走。将琼脂糖覆盖到细胞上之前，培养板应干燥，特别是在将要挑选空斑时。为达到这样的效果，我们通常会将培养板稍微倾斜，用Pasteur移液管沿培养板边缘吸一圈，同时小心不要破坏细胞单层。
如果培养板边缘有任何培养基残留（小液滴），则继续吸液。琼脂糖覆层“漂浮”，也可能导致野生型病毒污染。野生型病毒可以迁移到培养板的其他部分，从而污染重组型空斑。野生型病毒比重组型病毒复制得快的多，可迅速超过重组型病毒。
Q9
什么原因会导致培养板变蓝并形成蓝色空斑？
有几种原因可导致培养板变蓝：
病毒接种量过多。可尝试使用更高的稀释度。
加入热的融化琼脂糖时，将细胞烫死了。过热的琼脂糖会使细胞裂解，将lacZ释放到琼脂糖中，使其变蓝。应复查铺板温度。如果培养板过湿，蓝色会扩散。
0531-88031248
